Durante la mañana del 25 de mayo, una gran multitud comenzó a reunirse en la Plaza de la Victoria, actual Plaza de Mayo, liderados por los milicianos de Domingo French y Antonio Beruti. Se reclamaba la anulación de la resolución del día anterior, la renuncia definitiva del virrey Cisneros y la formación de otra Junta de gobierno.
La multitud invadió la sala capitular, reclamando la renuncia del virrey y la anulación de la resolución tomada el día anterior.
El Cabildo se reunió a las nueve de la mañana y reclamó que la agitación popular fuese reprimida por la fuerza. Con este fin se convocó a los principales comandantes, pero éstos no obedecieron las órdenes impartidas. Varios, entre ellos Saavedra, no se presentaron; los que sí lo hicieron afirmaron que no sólo no podrían sostener al gobierno sino tampoco a sí mismos, y que en caso de intentar reprimir las manifestaciones serían desobedecidos.
Cisneros seguía resistiéndose a renunciar, y tras mucho esfuerzo los capitulares lograron que ratificase y formalizase los términos de su renuncia, abandonando pretensiones de mantenerse en el gobierno. Esto, sin embargo, resultó insuficiente, y representantes de la multitud reunida en la plaza reclamaron que el pueblo reasumiera la autoridad delegada en el Cabildo Abierto del día 22, exigiendo la formación de una Junta. Además, se disponía el envío de una expedición de quinientos hombres para auxiliar a las provincias interiores.
Pronto llegó a la sala capitular la renuncia de Cisneros, "prestándose á ello con la mayor generosidad y franqueza, resignado á mostrar el punto á que llega su consideración por la tranquilidad pública y precaución de mayores desórdenes". La composición de la Primera Junta surge de un escrito presentado por French y Beruti y respaldado por un gran número de firmas. Sin embargo, no hay una posición unánime entre los historiadores sobre la autoría de dicho escrito. Algunos como Vicente Fidel López sostienen que fue exclusivamente producto de la iniciativa popular. Para otros, como el historiador Miguel Ángel Scenna, lo más probable es que la lista haya sido el resultado de una negociación entre tres partidos, que habrían ubicado a tres candidatos cada uno: los carlotistas, los juntistas o alzaguistas, y el "partido miliciano". Belgrano, Castelli y Paso eran carlotistas. Los partidarios de Álzaga eran Moreno, Matheu y Larrea. No hay duda de que Saavedra y Azcuénaga representaban al poder de las milicias formadas durante las invasiones inglesas; en el caso de Alberti, esta pertenencia es más problemática.
Los capitulares salieron al balcón para presentar directamente a la ratificación del pueblo la petición formulada. Pero, dado lo avanzada de la hora y el estado del tiempo, la cantidad de gente en la plaza había disminuido, cosa que Leiva adujo para ridiculizar la pretensión de la diputación de hablar en nombre del pueblo. Esto colmó la paciencia de los pocos que se hallaban en la plaza bajo la llovizna. A partir de ese momento (dice el acta del Cabildo),
...se oyen entre aquellos las voces de que si hasta entonces se había procedido con prudencia porque la ciudad no experimentase desastres, sería ya preciso echar mano a los medios de violencia; que las gentes, por ser hora inoportuna, se habían retirado a sus casas; que se tocase la campana de Cabildo, y que el pueblo se congregase en aquel lugar para satisfacción del Ayuntamiento; y que si por falta del badajo no se hacía uso de la campana, mandarían ellos tocar generala, y que se abriesen los cuarteles, en cuyo caso sufriría la ciudad lo que hasta entonces se había procurado evitar.
Cabe señalar que el badajo de la campana del cabildo había sido mandado retirar por el virrey Santiago de Liniers tras la asonada de Álzaga de 1809. Ante la perspectiva de violencias mayores, el petitorio fue leído en voz alta y ratificado por los asistentes. El reglamento que regiría a la Junta fue, a grandes rasgos, el mismo que se había propuesto para la Junta del 24, añadiendo que el Cabildo controlaría la actividad de los vocales y que la Junta nombraría reemplazantes en caso de producirse vacantes.
La Primera Junta estaba compuesta de la siguiente manera:
Presidente
Cornelio Saavedra
Vocales
Dr. Manuel Alberti
Cnel. Miguel de Azcuénaga
Dr. Manuel Belgrano
Dr. Juan José Castelli
Domingo Matheu
Juan Larrea
Secretarios
Dr. Juan José Paso
Dr. Mariano Moreno
La Junta estaba conformada por representantes de diversos sectores de la sociedad: Saavedra y Azcuénaga eran militares, Belgrano, Castelli, Moreno y Paso eran abogados, Larrea y Matheu eran comerciantes, y Alberti era sacerdote.
El mismo 25, Cisneros despachó a José Melchor Lavín rumbo a Córdoba, para advertir a Santiago de Liniers lo sucedido y reclamarle acciones militares contra la Junta.
